SPR技術(shù)揭示肝素抗膿毒癥新機制——分子互作研究的關(guān)鍵突破
2021年3月9日，國際頂級免疫學(xué)期刊《Immunity》發(fā)表了中南大學(xué)第三湘雅醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科呂奔教授團隊的重要研究成果《Heparin prevents caspase-11-dependent septic lethality independent of anticoagulant properties》。該研究首次闡明肝素通過阻斷HMGB1-LPS相互作用和抑制糖萼降解雙重機制，抑制caspase-11信號通路，為膿毒癥治療提供了全新視角。其中，表面等離子共振（SPR）技術(shù)在解析關(guān)鍵分子互作機制中發(fā)揮了決定性作用。 一、研究背景與意義 在膿毒癥中，肝細胞釋放的HMGB1蛋白作為分子伴侶能將血循環(huán)中的內(nèi)毒素（LPS）轉(zhuǎn)運至細胞漿中，從而活化了LPS的細胞漿受體—Caspase-11并造成臟器衰竭和死亡。研究團隊通過大樣本臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：接受低分子肝素治療的膿毒癥患者血清IL-1α/β水平顯著降低，但傳統(tǒng)凝血指標(biāo)（APTT/TT）未發(fā)生明顯改變。這一矛盾現(xiàn)象提示肝素可能存在獨立于抗凝功能的新型作用靶點。團隊進一步構(gòu)建肝素非抗凝衍生物（NAH）模型，發(fā)現(xiàn)其在小鼠膿毒癥模型中展現(xiàn)出與普通肝素相當(dāng)?shù)纳媛矢纳菩Ч?/span>p<0.01），為機制探索指明方向。 二、SPR實驗設(shè)計：解密分子互作的關(guān)鍵鑰匙 研究團隊通過系列SPR實驗揭示了肝素作用的核心機制： 肝素與HMGB1的高親和力驗證 通過SPR檢測發(fā)現(xiàn)，肝素及其非抗凝衍生物（NAH）均可與HMGB1蛋白特異性結(jié)合，平衡解離常數(shù)（KD）達5.59×10??，證明肝素家族分子具有直接調(diào)控HMGB1功能的能力。 特異性互作模式解析 對比實驗顯示：普通肝素可同時結(jié)合抗凝血酶III（KD=1.56 μM）和HMGB1，而NAH僅保留HMGB1結(jié)合能力。這完美解釋了NAH為何能在不引起抗凝副作用的情況下維持治療效果。 競爭性抑制機制可視化 HMGB1-LPS復(fù)合物的形成是膿毒癥惡化的重要環(huán)節(jié)。在HMGB1固定化芯片上，SPR實時監(jiān)測顯示：添加肝素后，LPS與HMGB1的結(jié)合信號顯著降低（響應(yīng)值下降>80%），首次從動力學(xué)角度證實肝素通過空間競爭阻斷HMGB1-LPS復(fù)合物形成。 三、SPR技術(shù)優(yōu)勢：從現(xiàn)象到機制的全鏈條解析 本研究成功展示了SPR技術(shù)在復(fù)雜生物學(xué)問題研究中的獨特價值： 精準(zhǔn)定量 通過多濃度梯度實驗和穩(wěn)態(tài)分析，精確測定肝素/HMGB1互作親和力，為后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐。 動態(tài)監(jiān)測 實時追蹤三元復(fù)合物（HMGB1-LPS-肝素）形成過程，解析競爭抑制的時間依賴性特征。數(shù)據(jù)顯示肝素在結(jié)合后30秒內(nèi)即可占據(jù)80%的HMGB1結(jié)合位點。 特異性區(qū)分 通過平行實驗明確不同肝素衍生物的靶向結(jié)合特性，指導(dǎo)NAH分子設(shè)計。團隊據(jù)此開發(fā)出硫酸化程度降低12%但HMGB1結(jié)合保留率達95%的新型衍生物。
Tang Y, Wang X, Li Z, He Z, Yang X, Cheng X, Peng Y, Xue Q, Bai Y, Zhang R, Zhao K, Liang F, Xiao X, Andersson U, Wang H, Billiar TR, Lu B. Heparin prevents caspase-11-dependent septic lethality independent of anticoagulant properties. Immunity. 2021 Mar 9;54(3):454-467.e6. doi: 10.1016/j.immuni.2021.01.007. Epub 2021 Feb 8. PMID: 33561388.
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