藥物靶點(diǎn)篩選是現(xiàn)代藥物研發(fā)的核心環(huán)節(jié)，而有限蛋白水解-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LiP-MS） 憑借其無(wú)需探針修飾和原位捕捉蛋白構(gòu)象變化的能力，已成為該領(lǐng)域的重要突破。以下從技術(shù)原理到前沿應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)解析：

一、技術(shù)原理：蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性的質(zhì)譜解碼

當(dāng)小分子藥物與靶蛋白結(jié)合時(shí)，會(huì)通過(guò)氫鍵等非共價(jià)作用穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，使其對(duì)抗蛋白酶水解的能力顯著增強(qiáng)。LiP-MS利用這一特性，通過(guò)三步實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)篩選：

有限酶解：在生理?xiàng)l件下用廣譜蛋白酶（如蛋白酶K）處理藥物-蛋白復(fù)合物，未結(jié)合蛋白被高效切割，而結(jié)合蛋白因構(gòu)象穩(wěn)定得以“保護(hù)”。

差異肽段生成：藥物結(jié)合區(qū)域的蛋白酶切位點(diǎn)暴露減少，產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)組特有的完整肽段（如案例中油酸結(jié)合的ENO1蛋白的R47-R67肽段）。

質(zhì)譜定量分析：通過(guò)高分辨質(zhì)譜（如4D-DIA/Tims-TOF）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的肽段豐度差異，定位潛在靶點(diǎn)及結(jié)合域，分辨率可達(dá)12個(gè)氨基酸。

關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)：相較于傳統(tǒng)方法（如化學(xué)探針修飾），LiP-MS直接在生理環(huán)境下捕獲天然構(gòu)象的蛋白-藥物相互作用，避免了因修飾導(dǎo)致的活性失真。

二、技術(shù)流程與核心優(yōu)勢(shì)

實(shí)驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化

樣本制備：使用細(xì)胞裂解液或組織提取總蛋白（需避免變性劑）

藥物孵育：小分子與蛋白在生理緩沖體系中孵育（通常15分鐘-2小時(shí)）

兩步酶解：先經(jīng)蛋白酶K有限水解，再用胰蛋白酶完全消化

質(zhì)譜檢測(cè)：LC-MS/MS定量分析差異肽段（如4D-DIA可提升檢測(cè)深度）

技術(shù)優(yōu)勢(shì)顯著：

無(wú)需修飾：直接使用原藥物分子，保留其天然活性

多維度數(shù)據(jù)：同時(shí)獲取蛋白豐度變化與構(gòu)象變化信息

高分辨率：可精確定位到單個(gè)功能結(jié)構(gòu)域（如金絲桃素結(jié)合Dlat蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域）

廣適用性：適用于變構(gòu)調(diào)節(jié)、酶-底物復(fù)合物等多種作用類型

局限性：對(duì)蛋白序列覆蓋率要求較高（需>30%），且動(dòng)態(tài)構(gòu)象可能干擾位點(diǎn)識(shí)別。

三、應(yīng)用場(chǎng)景：從靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)到機(jī)制解析

1. 藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

案例1-代謝物靶點(diǎn)：通過(guò)LiP-MS篩選出油酸結(jié)合靶點(diǎn)ENO1（烯醇化酶1）和異膽酸靶點(diǎn)FXR1，經(jīng)SPR驗(yàn)證結(jié)合力（KD=10.6μM/32.9μM）。

案例2-天然產(chǎn)物抗肥胖機(jī)制：鑒定出金絲桃素（HPF）直接結(jié)合二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶（Dlat），激活A(yù)MPK-PGC1α軸以促進(jìn)脂肪褐變。

2. 結(jié)合位點(diǎn)分析

針對(duì)已知靶點(diǎn)（如純化重組蛋白），LiP-MS可解析藥物結(jié)合域。例如在衰老研究中，鎖定谷氨酸合成酶Glt1的聚合界面，突變?cè)搮^(qū)域可恢復(fù)氨基酸穩(wěn)態(tài)并延長(zhǎng)壽命。

3. 多組學(xué)整合研究

結(jié)構(gòu)-功能關(guān)聯(lián)：結(jié)合轉(zhuǎn)錄組/代謝組數(shù)據(jù)，揭示靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（如酵母衰老中Glt1聚合與線粒體功能障礙的關(guān)聯(lián)）。

脫靶效應(yīng)篩查：高通量檢測(cè)非目標(biāo)蛋白結(jié)合情況，評(píng)估藥物安全性。

四、方法學(xué)比較：LiP-MS vs DARTS

二者均為免標(biāo)記靶點(diǎn)篩選技術(shù)，但存在顯著差異：

五、技術(shù)演進(jìn)與未來(lái)方向

儀器創(chuàng)新：4D-質(zhì)譜（timsTOF HT）提升檢測(cè)靈敏度與肽段覆蓋率

算法優(yōu)化：分子對(duì)接模擬（如Autodock Vina）輔助驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)，降低假陽(yáng)性

活體應(yīng)用：開發(fā)體內(nèi)LiP-MS（in vivo LiP），直接在動(dòng)物模型中捕捉藥物-靶點(diǎn)互作

臨床轉(zhuǎn)化：整合疾病生物標(biāo)志物篩選（如神經(jīng)退行性疾病中淀粉樣蛋白構(gòu)象變化）

如2021年《Cell》研究所述，LiP-MS已實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平蛋白動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)監(jiān)測(cè)，為精準(zhǔn)藥物設(shè)計(jì)提供新范式。

LiP-MS憑借其原位捕捉蛋白構(gòu)象變化的能力，重塑了藥物靶點(diǎn)篩選的邏輯框架。隨著高分辨質(zhì)譜與計(jì)算模擬的深度融合，該技術(shù)有望在變構(gòu)藥物開發(fā)和多靶點(diǎn)系統(tǒng)藥理研究中釋放更大潛力，推動(dòng)藥物研發(fā)從“經(jīng)驗(yàn)篩選”邁向“數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)”的新階段。

研錦生物可以利用基于靶點(diǎn)或小分子結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法，對(duì)可購(gòu)買化合物、天然產(chǎn)物等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，并獲得潛在活性的化合物列表供進(jìn)一步活性實(shí)驗(yàn)確證。面向制藥企業(yè)和科研院所，可提供一站式的早期藥物研發(fā)服務(wù)，包括虛擬藥物篩選、先導(dǎo)優(yōu)化、靶標(biāo)預(yù)測(cè)、 動(dòng)力學(xué)模擬等，涉及小分子化學(xué)藥、生物藥、中藥等多種新藥類型，為您提供優(yōu)質(zhì)的藥物發(fā)現(xiàn)服務(wù)