靶點識別是新藥研發(fā)的核心瓶頸，尤其對于天然產(chǎn)物這類難以修飾的小分子而言。有限蛋白酶解-質譜聯(lián)用技術（LiP-MS）憑借無需探針標記、可捕獲天然狀態(tài)蛋白構象變化的獨特優(yōu)勢，成為藥物靶點發(fā)現(xiàn)領域的新銳工具。然而，其在復雜體系中的應用仍面臨假陽性干擾、低豐度蛋白漏檢等現(xiàn)實挑戰(zhàn)。本文結合最新研究進展，系統(tǒng)解析LiP-MS的技術原理、優(yōu)化策略與前沿應用，為實現(xiàn)精準"釣靶"提供方法論參考。

一、技術原理：從構象變化到靶點解碼

LiP-MS的核心機制在于利用小分子與靶蛋白結合引發(fā)的空間構象改變，影響蛋白酶對特定切割位點的可及性。其技術流程主要分為三步：

1. 非變性孵育：

在生理條件下將小分子與細胞裂解液或組織蛋白共孵育，維持蛋白質的天然構象；

2. 兩步酶解：

有限酶切：加入廣譜蛋白酶（如蛋白酶K）進行短暫水解，小分子結合區(qū)域因構象穩(wěn)定或位阻效應受到保護，切割作用減弱；

深度酶切：變性后用胰蛋白酶徹底消化，生成適合質譜分析的肽段；

3. 差異肽段分析：

通過質譜定量比較處理組與對照組的肽段豐度差異，受保護肽段（豐度升高）與鄰近新暴露肽段（豐度降低） 的組合可映射出小分子結合位點。

典型案例：在紫堇靈（Corynoline）抗胰腺纖維化研究中，LiP-MS檢測到蛋白酶體亞基PSMA2的一個長肽段（含潛在PK酶切位點）豐度顯著升高，而相鄰短肽段豐度降低，提示紫堇靈可能結合于二者交界區(qū)域。后續(xù)DARTS實驗進一步驗證了這一結合的特異性。

二、應用挑戰(zhàn)與假陽性陷阱

盡管原理清晰，LiP-MS在實際應用中仍面臨多重技術瓶頸：

低豐度蛋白檢出率低：高豐度蛋白的信號易掩蓋調控蛋白（如激酶、轉錄因子），導致關鍵靶點遺漏；

半酶切肽段干擾：第一步PK酶切的肽段（反映構象變化）與第二步胰酶肽段共存，難以精準區(qū)分關鍵信號；

序列覆蓋率不足：若結合位點位于未被質譜覆蓋的肽段區(qū)域（尤其大分子量蛋白），則無法被識別；

假陽性率高：單劑量實驗中，非特異性結合與背景噪聲難以區(qū)分，導致靶點驗證失敗率較高。

表：LiP-MS與主流靶點鑒定技術比較 

三、精準靶點篩選策略：從"大海撈針"到"有的放矢"

為解決上述問題，研究者開發(fā)了多維度數(shù)據(jù)整合策略，顯著提升了靶點鑒定效率：

1. 特征肽段驅動法

通過識別"長肽段增加+短肽段減少"的特征組合鎖定靶點，例如紫堇靈研究中對PSMA2的鑒定。

2. 多濃度交集-機器學習聯(lián)用

多劑量篩選：采用≥3個藥物濃度處理，取共有差異蛋白以降低假陽性（如血根堿研究中通過3濃度交集獲得6個候選靶點）；

算法輔助：聯(lián)合GalaxySagittarius等預測工具進行交叉驗證（血根堿案例中，多濃度交集與預測結果僅PKM2重疊）。

3. 生物學功能關聯(lián)

通路富集：重樓皂苷II的LiP-MS差異蛋白富集于核轉運通路，據(jù)此鎖定RAN靶點；

表型關聯(lián)：鹽酸石蒜堿的16個候選靶點中，UBA1因參與衰老通路被優(yōu)先驗證；

酶底物庫篩選：磺胺羅汀研究中，通過差異蛋白與糖基轉移酶庫取交集發(fā)現(xiàn)FUT8。

表：經(jīng)典LiP-MS靶點篩選策略與驗證方法 

四、技術優(yōu)化與融合應用

1. LiP-Quant：機器學習賦能精準定量

升級版LiP-Quant通過7個以上藥物濃度梯度孵育，結合機器學習模型（如隨機森林、支持向量機）分析肽段豐度-劑量響應曲線，顯著提升了特異性。實驗表明，其假陽性率較傳統(tǒng)LiP-MS降低40%。

2. 多技術聯(lián)建"證據(jù)鏈"

單一技術的證據(jù)往往不足，需聯(lián)合正交驗證：

結合力驗證：通過SPR測定結合常數(shù)（如石蒜堿-UBA1的KD=0.8 μM）；

細胞熱穩(wěn)定性：利用CETSA檢測靶蛋白熔解溫度偏移（如貫葉金絲桃素-Dlat復合物ΔTm=3.2℃）；

功能回復實驗：通過敲低/過表達靶點觀察表型逆轉。

3. 樣本處理與算法革新

4D-DIA質譜：提高低豐度肽段檢出率，使序列覆蓋率提升30%；

深度學習模型：如AlphaFold2預測結合口袋，輔助肽段定位。

五、未來方向：從技術突破到臨床轉化

1. 覆蓋度提升：

發(fā)展交聯(lián)質譜（XL-MS） 輔助定位結合界面，彌補酶切盲區(qū)；

2. 體內靶點垂釣：

直接分析動物給藥后組織樣本，同步獲取靶點occupancy與轉錄組/蛋白組響應（如燈盞乙素腦組織靶向PDK2研究）；

3. 天然產(chǎn)物開發(fā)：

無需純化探針的特性使其特別適合中藥單體（如黃酮、生物堿）靶點發(fā)掘，助力中醫(yī)藥現(xiàn)代化；

4. 臨床診斷應用：

利用LiP-MS檢測疾病相關構象變化蛋白，作為帕金森病、癌癥的早期生物標志物。

案例啟示：肌苷（中藥冬蟲夏草成分）通過LiP-MS被發(fā)現(xiàn)靶向泛素活化酶UBA6，并證實其可增強腫瘤免疫原性。該研究為天然產(chǎn)物改造免疫檢查點抑制劑提供了新路徑。

LiP-MS憑借無需探針、可解析結合位點的優(yōu)勢，已成為藥物靶點發(fā)現(xiàn)的核心工具。通過多濃度設計、機器學習整合及多維驗證，可顯著提升其在復雜體系中的可靠性。隨著高靈敏度質譜與人工智能算法的深度融合，LiP-MS有望在靶向蛋白降解劑開發(fā)、天然藥物現(xiàn)代化及精準醫(yī)療領域實現(xiàn)更突破性的應用。研究者需根據(jù)樣本復雜度與小分子特性靈活設計策略，方能在"數(shù)據(jù)迷霧"中鎖定真正的靶點燈塔。

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