北大曾克武/屠鵬飛教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Advanced Science上發(fā)表了題為“Allosteric Activation of Transglutaminase 2 via Inducing an ‘Open’ Conformation for Osteoblast Differentiation”的研究論文，本文基于點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建毛喉素的小分子活性探針，從小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中“釣”出其直接作用靶點(diǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2（TGM2），深入闡明了天然活性小分子化合物毛喉素（forskolin）治療骨質(zhì)疏松的分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

研究背景

·成骨細(xì)胞在骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，其功能障礙可導(dǎo)致嚴(yán)重骨骼疾病。

·毛喉素（FSK）是傳統(tǒng)藥用植物毛喉鞘蕊花的代表性活性成分，具有一定的促成骨分化的作用，表明對(duì)其骨質(zhì)疏松癥等骨病具有潛在的治療作用

·谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2（TGM2）是一種多功能酶，有研究表明TGM2可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化并改善骨量減少和抑制破骨細(xì)胞數(shù)的增多，但尚未有研究報(bào)道候選藥物靶向TGM2促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨重建。

研究方法

·使用FSK作為化學(xué)探針，通過(guò)合成含有光親和標(biāo)簽和點(diǎn)擊化學(xué)手柄的FSK分子探針（AD-FSK）來(lái)識(shí)別細(xì)胞靶點(diǎn)。

·通過(guò)多種生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法（如SPR分析、LC-MS/MS、分子動(dòng)力學(xué)模擬等）研究FSK與TGM2的相互作用。

其中鑒定FSK的直接作用靶點(diǎn)

基于點(diǎn)擊化學(xué)合成，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定FSK作用靶點(diǎn)，通過(guò)表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)、Pull-down實(shí)驗(yàn)、CETSA實(shí)驗(yàn)、DARTS實(shí)驗(yàn)證明了毛喉素直接與MC2T3-E3細(xì)胞中的TGM2結(jié)合。

ABPP：

探針合成：研究人員合成了帶有光親和標(biāo)記和點(diǎn)擊化學(xué)手柄的FSK探針（AD-FSK），用于在細(xì)胞內(nèi)捕獲TGM2及其相互作用蛋白。

光親和標(biāo)記：將AD-FSK與MC3T3-E1細(xì)胞共同孵育后，通過(guò)UV照射誘導(dǎo)探針與靶蛋白形成共價(jià)鍵。

點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)：利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將生物素-PEG-疊氮化物或5-TAMRA-疊氮化物連接到探針標(biāo)記的蛋白質(zhì)上。

親和純化與質(zhì)譜分析：通過(guò)鏈霉親和素磁珠富集標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析（LC-MS/MS），以鑒定與TGM2相互作用的蛋白質(zhì)。

SPR:

通過(guò)SPR分析，研究人員發(fā)現(xiàn)FSK能夠直接與TGM2結(jié)合，解離常數(shù)（Kd）為3.1 μM，表明FSK與TGM2之間存在中等強(qiáng)度的結(jié)合。

CETSA-WB

在CETSA實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)FSK處理后的MC3T3-E1細(xì)胞中，TGM2的熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，表明FSK與TGM2結(jié)合后改變了其構(gòu)象，使其更加穩(wěn)定。

總結(jié)：

·ABPP用于鑒定與TGM2相互作用的蛋白質(zhì)，揭示了TGM2在成骨細(xì)胞分化中可能涉及的分子機(jī)制和信號(hào)通路。

·SPR技術(shù)直接驗(yàn)證了FSK與TGM2之間的結(jié)合，并測(cè)定了結(jié)合親和力。

·CETSA-WB技術(shù)通過(guò)評(píng)估TGM2的熱穩(wěn)定性變化，間接證明了FSK與TGM2的結(jié)合及其對(duì)TGM2構(gòu)象的影響。

這些技術(shù)的綜合應(yīng)用為深入理解TGM2在成骨細(xì)胞分化中的作用及其變構(gòu)激活機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

研錦生物可以利用基于靶點(diǎn)或小分子結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法，對(duì)可購(gòu)買(mǎi)化合物、天然產(chǎn)物等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，并獲得潛在活性的化合物列表供進(jìn)一步活性實(shí)驗(yàn)確證。面向制藥企業(yè)和科研院所，可提供一站式的早期藥物研發(fā)服務(wù)，包括虛擬藥物篩選、先導(dǎo)優(yōu)化、靶標(biāo)預(yù)測(cè)、 動(dòng)力學(xué)模擬等，涉及小分子化學(xué)藥、生物藥、中藥等多種新藥類型，為您提供優(yōu)質(zhì)的藥物發(fā)現(xiàn)服務(wù)