膽固醇是動物細胞膜中的重要脂質成分，與多種蛋白質存在相互作用。然而，由于膽固醇在水中的溶解度低，傳統(tǒng)研究方法存在局限性。2022年發(fā)表“Cholesterol Chip for the Study of Cholesterol–Protein Interactions Using SPR”利用SPR技術研究膽固醇與蛋白質的相互作用，揭示其動力學特性。

本研究合成生物素化膽固醇，將其固定在鏈霉親和素（SA）芯片上，通過SPR技術測量不同濃度的Hedgehog（Hh）和PTP1B蛋白與膽固醇的結合動力學，得到結合速率常數(shù)（ka）、解離速率常數(shù)（kd）和解離常數(shù)（KD）。

結合速率常數(shù)（ka）：通過比較不同蛋白質濃度下的結合速率（即RU增加的速度），可以擬合出結合速率常數(shù)。ka值越大，表示結合速率越快。

解離速率常數(shù)（kd）：解離相反映了蛋白質從膽固醇表面解離的速度。通過擬合解離過程，可以得到解離速率常數(shù)kd。kd值越大，表示解離速率越快。

解離常數(shù)（KD）：KD是評價蛋白質與膽固醇結合親和力的關鍵參數(shù)，它等于解離速率常數(shù)與結合速率常數(shù)的比值（KD = kd / ka）。KD值越小，表示結合親和力越強。

SPR實驗的關鍵步驟

樣品準備：合成生物素化膽固醇。同時，準備待測的膽固醇結合蛋白樣品。

實驗設置：將SA芯片安裝到SPR儀器上，設置實驗參數(shù)，如流速、注射時間等。并將生物素化膽固醇固定在鏈霉親和素（SA）芯片上。

數(shù)據(jù)收集：將不同濃度的膽固醇結合蛋白樣品依次注射到芯片表面，通過SPR儀器實時監(jiān)測蛋白質與膽固醇的結合過程。

SPR實驗結果分析

Hh與膽固醇的相互作用：結合速率常數(shù)ka為1.81×10⁵ （±500）（1/Ms），解離速率常數(shù)kd為2.60×10^-3（±1.20×10^-4）（1/s），解離常數(shù)KD約為14 nM。

PTP1B與膽固醇的相互作用：結合速率常數(shù)ka為1.33×10⁴ （±220）（1/Ms），解離速率常數(shù)kd為1.9×10^-3 （±7.4×10^-6）（1/s），解離常數(shù)KD約為85 nM。

SPR實驗的優(yōu)勢

實時監(jiān)測：SPR技術可以實時監(jiān)測生物分子間的相互作用過程，無需對樣品進行標記或處理。

高靈敏度：SPR儀器對折射率的變化非常敏感，可以檢測到納摩爾級別的生物分子相互作用。

樣品需求量少：與核磁共振（NMR）或X射線晶體學等方法相比，SPR技術具有樣品需求量少、實時測量動力學參數(shù)等優(yōu)勢。

研究結論：成功合成了生物素化膽固醇并將其固定在SA芯片上，通過SPR技術研究了膽固醇與Hh和PTP1B的相互作用動力學。

該方法為研究膽固醇與其他蛋白質的相互作用提供了新的途徑，有望促進對膽固醇生物學功能的深入理解。

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